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指纹图谱停止用于网药瞻望:成都中医药大-基于指纹图谱和搜集药理学对经典名方二冬汤Q-Marker预测领略
时间:2022-10-04 09:12 点击次数:83

  经典名方是中医热闹和历代医家临床施行的结晶,凝集着各代医家的灵巧,开发与研讨经典名方既有利于传承中医文化,有利于今生中医药的繁荣。 2018 年,国家中医药桎梏局公布了《守旧经典名方目录(第一批)》 [1] ,二冬汤被收录于其中。二冬汤出自清代程国彭所著的《医学心悟》卷三 [2] ,全方由天冬、麦冬、天花粉、黄芩、知母、甘草、人参、荷叶组成,主治上消,具有养阴清热、生津止渴之效用,临床上常被用于调理糖尿病、百日咳、肺结核、慢性支气管炎、阴虚咳嗽等 [3-8] 。

  因中药具有多成分、多靶点的特性,检测其任何一种要素均不能代表其整个药效,且由于中药的混乱性导致中药质地限制指标与其有效性联系度低且专属性差等标题,所以刘昌孝院士 [9] 于 2016 年初次提出了原料标帜物( quality markers , Q-Marker )的概念,旨在更好地范围中药材的质料 [10] 。而中药指纹图谱能严密、定量地体认中药所包含的化学信休,是中药原料范围的主要手段,同时在经典名方物质基准的斟酌中也成为厉浸才智 [11] 。收集药理学具有闭座性、系统性的特征与中医药举座观、辨证论治轨则类似,其履历修设“身分 - 靶点 - 通路”收集拓扑学干系图不妨直观反响药物发挥药效的特质,增长复方临床行使的科学性 [12] 。本酌量将指纹图谱与收集药理学相衔尾,并诈欺相仿度评议软件和聚类贯通,可以加倍体系、细密地对其质料实行限制,瞻望其阐发药效的潜在 Q-Marker ,并同时代析指纹图谱的材料控制指标是否合理,可为二冬汤后续探求提供可行性参考。

  2.2.1水煎液的制备 二冬汤始载于清代程国彭所著的《医学心悟》卷三,文中记录:“,治上消者,宜润其肺,兼清其胃,二冬汤主之 … 治上消,天冬(二钱,去心),麦冬(三钱,去心),花粉(一钱),黄芩(一钱),知母(一钱),甘草(五分),人参(五分),荷叶一钱,水煎服。”按照中医药办理局颁布的古板经典名方环节信休表( 7 首丹方) [13] 并查阅联系文献必然,清代一钱等于现今 3.73 g ,一钱等于特别。因方中煎服身手仅有“水煎服”,故参照 2009 年国家中医药执掌局对付印发的《调理机构中药煎药室执掌模范》和有关文献并邻接考试室前期试验,笃信二冬汤模范汤剂的制备伎俩:称取天冬 11.19 g ,麦冬 16.78 g ,天花粉 5.60 g ,黄芩 5.60 g ,知母 5.60 g ,甘草 2.81 g ,人参 2.81 g ,荷叶 5.60 g ,共 55.60 g ,加简单水 650 mL ,加盖浸泡 30 min ,武火煮沸后转文火煎煮 30 min ,药渣再加 550 mL 水加热煮沸 30 min ,趁热用 100 目滤布滤过,闭并 2 次滤液,放冷加自来水定容至 1000 mL 量瓶中,即得。

  2.2.2搀杂比拟品的制备 精华称取新芒果苷、芒果苷、金丝桃苷、黄芩苷、千层纸素 -3-O-β-D- 葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、甘草酸铵适量于 25 mL 量瓶中,加甲醇制成质料浓度离别为 0.128 、 0.048 、 0.040 、 0.072 、 0.052 、 0.048 、 1.960 g/L 的搀杂对照品溶液。

  2.3.1结实性考试 取统一水煎液 ( S1 ) 供试品溶液,离去在制样后 0 、 2 、 4 、 8 、 12 、 24 h 后测定,以 23 号色谱峰为参照峰( S ),猜度各共有峰相对保全时候的 RSD 均小于 0.6% ,相对峰面积的 RSD 均小于 4% ,各图谱沟通度均大于 0.96 ,注明供试品溶液在 24 h 内坚实。

  2.3.2精彩度测试 取团结份水煎液 ( S1 ) 供试品溶液,按上述色谱条件相接进样 6 次,以 23 号色谱峰为参照峰( S ),猜想各峰的相对保全时期的 RSD 均小于 0.4% ,相对峰面积的 RSD 均小于 3% ,各图谱相似度均大于 0.96 ,注脚仪器精密度卓异。

  2.3.3再三性实验 取同一水煎液( S1 ),凭借“ 2.2.3 ”项下技艺制备 6 份供试品溶液,按“ 2.1 ”项下色谱要求测定,以 23 号峰为参照峰( S ),解散各峰的相对保全韶光的 RSD 均小于 0.4% ,相对峰面积的 RSD 均小于 5% ,各图谱相通度均大于 0.95 ,声明该才具频频性优秀。

  取 15 批二冬汤供试品溶液,按“ 2.1 ”项下色谱要求进行进样检测,纪录色谱图。选拔“中药色谱指纹谱图相似度评价体例( 2012 版)”实行数据理解,以 S1 为参照图谱,时期窗宽度设定为 0.1 min ,选取中位数法,实行多点校订和 Mark 峰成家,天才二冬汤指纹图谱及其对照指纹图谱(共有模式, R ),下场见图 1 。共标定 26 个共有峰,此中指认 7 个共有峰,离别为 4 号峰新芒果苷、 6 号峰芒果苷、 10 号峰金丝桃苷、 17 号峰黄芩苷、 21 号峰千层纸素 -3-O-β-D- 葡萄糖醛酸苷、 23 号峰汉黄芩苷、 26 号峰甘草酸铵。

  取二冬汤物质基准样品 S1 以及缺天冬、缺麦冬、缺天花粉、缺黄芩、缺知母、缺甘草、缺人参、缺荷叶的阴性样品,按“ 2.2.3 ”项下才干制备供试品溶液,按“ 2.1 ”项下色谱条目测定,记录色谱图。

  连关色谱峰的保存年光及紫外摄取图,经过对比融会,对 26 个共有峰实行归属,见图 2 。结局发掘 4 ~ 7 号峰来自知母, 11 、 15 ~ 24 号峰来自黄芩, 1 、 9 、 10 ~ 14 号峰来自荷叶, 25 、 26 号峰来自甘草, 2 、 3 号峰为知母荷叶共有峰,黄芩在该条目下出峰较多,因天冬、麦冬、天花粉身分大多为多糖类,自己药典也无紫外检测,故在本指纹图谱下无功劳。

  HCA 常用于数据的劈头琢磨性认识,具有直观、结论体例简捷的特色 [14] 。选择 SPSS 21.0 数据理解软件,对 15 批样品的共有峰的峰面积举办系统聚类领悟,选取组间衔接法,丈量区间为平方欧氏间隔,聚类下场见图 3 ,告终发现当欧氏间隔为 10 时,将 15 批二冬汤物质基准可分为 2 类,样品 S1 、 S5 、 S9 、 S11 、 S15 为第 1 类,样品 S2 ~ S4 、 S6 ~ S8 、 S10 、 S12 ~ S15 为第 2 类,讲明例外产地间药材质料糊口必定的差异性。

  2.8.1基于可测性和可溯性的候选化合物筛选 按照相干文献研究,黄芩告急要素为多糖和黄酮类,黄芩的质料部分指标黄芩苷在范围高血糖中分析沉 要效用,其没合系经过增加人体谷胱甘肽过氧化酶( glutathione peroxidase , Gpx )活性,降低三酰甘油与总胆固醇水准,从而改正人体血糖,汉黄芩苷也为其黄酮类要素,具有抗炎、珍贵心脑血管等影响 [15] 。知母的主要要素为皂苷、双苯吡酮类、生物碱类,知母的质地范围指标芒果苷和其我身分如新芒果苷具有卓异的降血糖效用 [16] 。甘草急急身分为三萜类、黄酮类、多糖类等此外因素,甘草的局部指标甘草酸具有较好的降血糖、调养免疫和抗动脉粥样化影响 [17] 。荷叶的沉要活性要素为生物碱和黄酮类,金丝桃苷具有调脂感化 [18] 。天冬、麦冬、人参紧张活性成分为皂苷和多糖类 ,天花粉的活性因素为多糖类。结合文献咨议和指纹图谱推敲,以上 6 个身分均可以得到指认和测定,且不妨完成饮片到物质基准对应实物的通报。基于可测性和可溯性,将以上 6 个化合物行径候选化合物。操纵 NCBI 数据( )搜求这 6 个候选化合物的 Canonical SMILES ,为后续研讨做谋划。

  2.8.2二冬汤紧要化学因素的靶蛋白预计 将 6 个活性要素的 Canonical SMILES 差别输入 Swiss Target Prediction 数据库( )举行其对应靶蛋白的预测,将相关靶蛋白举办整理,去除一再靶点,共得到 6 个活性要素作用的 252 个靶点。

  2.8.5成分- 靶点- 汇集的构建 依照筛选得到的 6 个身分、 21 个枢纽靶点和 56 条通路导入 Cytoscape 3.7.1 软件,修筑二冬汤“身分 - 靶点 - 搜集”搜集图,完成见图 7 ,由图可知,二冬汤效率于多个靶点、多条通叙施展效率。

  由此可知,汇集药理学的展望停止与已有文献报讲较为相似,解释该研讨技巧具有必定的实在性和可取性。同时,这 6 个有效身分可经验效力于多靶点,干预多条通路发扬药效效力,进一步注释指纹图谱所选的指标要素具有闭理性。这 6 个要素无妨从饮片 - 煎液实行卓着的转达和溯源,且无阴性侵犯,基于 Q-Marker 的五原则,新芒果苷、芒果苷、金丝桃苷、汉黄芩苷、黄芩苷、甘草酸铵都根本符合,故可发端瞻望其为二冬汤潜在的 Q-Marker 。

  中药复方要素繁杂,为对其质料举办周到限度,本考试差别覆按了甲醇 - 水、乙腈 - 水、乙腈 -0.1% 磷酸水溶液、甲醇 -0.1% 甲酸水溶液、乙腈 -0.1% 甲酸水溶液 5 种各异的震撼相下色谱峰的告别境遇,终了开掘震动相为乙腈 - 水、甲醇 - 水时,峰较少,惊动相为乙腈 -0.1% 磷酸水溶液、甲醇 -0.1% 甲酸水溶液、乙腈 -0.1% 甲酸水溶液时,峰数量亲近,但乙 腈 -0.1% 甲酸水溶液体系各峰分辩效率好,故采用乙腈 -0.1% 磷酸水溶液为轰动相。同时,对 203 、 230 、 254 、 270 、 290 nm 等例外检测波长实行了覆按,阅历较量开掘 203 nm 和 230 nm 基线 nm 中指标性因素甘草酸铵峰面积更高,故选取 254 nm 。其余,查考了色谱柱温度( 25 、 30 、 35 ℃),体积流量( 0.8 、 1.0 、 1.2 mL/min )及例外规范色谱柱,最后必然上述色谱条件。

  本磋商采取 HPLC 法开发二冬汤的指纹图谱,筛选出 26 个共有峰,并对 7 个峰实行了指认,经与各单味药阴性色谱图对照,获得知母、荷叶、黄芩、荷叶 4 味饮片的特色峰,此中开头于黄芩的色谱峰较多,天冬、麦冬、天花粉吃紧身分为多糖和皂苷类,不齐全紫外检测的特征,履历课题组前期考试,这 4 味药可通过薄层或分光光度法举办区别。采用相通度评议软件毗连聚类了解,将 15 批药材分为 2 类,诠释各异产地的药材因气候、海拔等讲理会形成一定的分歧。指纹图谱行动材料限定的技能之 一,还需接连多指标成分的含量测定、出膏率、大类因素含量测定等本事对经典名方质料进行全方位限度。

  中药质地是教授中药奇迹发达的症结因素, Q-Marker 基于中药化学因素与中药安全性、有效性,选择中药中少许可测性要素行为质地控制指标,发展中药可控性和溯源性,鼓励中药材料的限度磋议。本尝试基于 Q-Marker 可测、奇特、有效、传递及配伍“五准则”,起先拔取高效液相色谱法建设规范汤剂的指纹图谱,并指认出关系峰,预计出二冬汤或者的材料记号物,体现中药原料的可测性。随后选拔网络药理学的手段从有效性方面对 6 个或者的标志物成分举行靶点展望及相干通讲的富集,其主要涉及蛋白酪磷酸酶 N1 、 INSR 、 EGFR 等 21 个靶点,富集的通路包罗 FoxO 通叙、 PI-3K-AKT 等 56 条密码通讲,且涉及的靶点和通谈大多与颐养糖尿病关连症状相干 [29-30] ,这与古方记载“调养上消”相似,来源糖尿病属于上消范围。但汇集药理学仍生计少许限制性,后续仍需要经过极少药理测验实行验证以鼓励二冬汤质料类型的开发。

  综上所述,本测试基于指纹图谱和收集药理学考虑解说新芒果苷、芒果苷、金丝桃苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵这 6 个身分大概为二冬汤的潜在 Q-Marker ,为二冬汤质量局部及后续筹议供给了参考。

  来 源:帅丽霞,陈 旺,袁 袁,阮 佳,詹 雁,徐出众.基于指纹图谱和收集药理学对经典名方二冬汤材料象征物(Q-Marker)瞻望体会 [J]. 中草药, 2022, 53(18): 5682-5691 .

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